動(dòng)物膜蛋白提取試劑盒（細(xì)胞樣品）

(Animal Membrane Protein Extraction Kit for Cells)

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介

動(dòng)物膜蛋白提取試劑盒（細(xì)胞樣品）(Animal Membrane Protein Extraction Kit for Cells)提供了一種簡(jiǎn)便的地從培養(yǎng)細(xì)胞或貼壁細(xì)胞中提取膜蛋白的方法。提取的膜蛋白不僅包括質(zhì)膜上的膜蛋白，也包括細(xì)胞器膜如線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和高爾基體膜上的膜蛋白。

本產(chǎn)品與許多用于分離膜蛋白的程序不同，該試劑盒不需要超聲，不需要耗時(shí)的超速離心，不使用去垢劑，最大限度地保持了膜蛋白在細(xì)胞內(nèi)的原始狀態(tài)。提取的基本原理是通過(guò)提取溶液和離心柱的協(xié)調(diào)作用提取得到高純度的膜蛋白。膜蛋白提取溶液可以溫和作用于細(xì)胞膜，改變細(xì)胞的滲透壓，然后在高速離心下細(xì)胞通過(guò)離心柱，這個(gè)過(guò)程中細(xì)胞膜會(huì)破裂；收集液700 g低速離心分離去除細(xì)胞核，因此消除了膜組分中細(xì)胞核組份的污染；隨后上清使用常規(guī)臺(tái)式低溫離心機(jī)（無(wú)需超速離心）16000 g高速離心，沉淀即為膜蛋白。

該產(chǎn)品約60分鐘即可完成培養(yǎng)細(xì)胞膜蛋白的提取。膜蛋白是在溫和、非變性條件下提取的，結(jié)合不同的溶解液，溶解后的膜蛋白可以用于SDS-PAGE變性電泳檢測(cè)、Blue Native非變性電泳檢測(cè)以及等電聚焦電泳等。另外，膜蛋白也可以用于酶活性測(cè)定，免疫沉淀，ELISA測(cè)定等。

對(duì)于細(xì)胞樣品，如果每次使用細(xì)胞的數(shù)量為2-5×10⁶，本試劑盒可以提取125個(gè)樣品；如果每次使用的細(xì)胞數(shù)量為1×10⁷細(xì)胞，本試劑盒可以提取50個(gè)樣品。

● 產(chǎn)品組成

● 貯存、效期和運(yùn)輸：

根據(jù)標(biāo)簽溫度貯存；一年有效；試劑盒常溫運(yùn)輸。

● 用前必讀：

1. 離心機(jī)請(qǐng)調(diào)整成RCF/g模式，按照離心力設(shè)置離心機(jī)（不要根據(jù)轉(zhuǎn)速rpm模式設(shè)置），所有離心步驟都需要在4℃低溫離心機(jī)中進(jìn)行。

2. 將膜蛋白提取溶液混勻后放置于冰上。將離心柱套入2 ml連蓋收集管中，蓋好管蓋，放置于冰上預(yù)冷。

3. 蛋白提取推薦添加蛋白酶抑制劑（自備，試劑盒不提供），根據(jù)蛋白酶抑制劑母液濃度提前添加在膜蛋白提取溶液中（如抑制劑母液是 100×，添加時(shí)按照1:100添加，即1ml膜蛋白提取溶液添加10μl抑制劑）。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自備，試劑盒不提供）。

4. 蛋白定量推薦使用BCA方法，可以選擇BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：RTP7102）。

● 使用方法：

一 培養(yǎng)細(xì)胞膜蛋白提取：

1.1 準(zhǔn)備溶液：

混勻膜蛋白提取溶液，立即放置在冰上。取適當(dāng)量的溶液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑（自備，試劑盒不提供），隨后立即放于冰上待用。按照下表大體估算膜蛋白提取溶液使用體積：

注： (二百萬(wàn)，2×10⁶)HeLa細(xì)胞，其細(xì)胞沉淀體積（PCM，Packed Cell Volume）大約為20 μl。

1.2 準(zhǔn)備細(xì)胞：

1.2.1 對(duì)于貼壁細(xì)胞：細(xì)胞用PBS漂洗一遍，棄PBS；再加入適量PBS，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，或用0.02% EDTA（0.5 mM）溶液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細(xì)胞。400 g（~2000 rpm） 4℃離心5 min收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需提取的目的蛋白。

1.2.2 對(duì)于懸浮細(xì)胞：400 g（~2000 rpm）4℃離心5 min收集細(xì)胞，用PBS洗一遍，離心收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。

1.3 裂解細(xì)胞膜：

1.3.1細(xì)胞沉淀中加入準(zhǔn)備好的膜蛋白提取溶液（含蛋白酶抑制劑），用移液器吹打重懸細(xì)胞沉淀，渦旋劇烈震蕩30-60秒，冰浴處理10分鐘，間歇2-3混勻。

注：提取溶液使用推薦經(jīng)驗(yàn)值：起始細(xì)胞數(shù)低于5×10⁶加入 200 μl 提取溶液，起始細(xì)胞數(shù)量5×10⁶-1×10⁷加入500 μl提取溶液。如果細(xì)胞數(shù)目低于1×10⁶或高于1×10⁷，建議調(diào)整細(xì)胞數(shù)目在2-5×10⁶范圍內(nèi)。

1.3.2 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心柱中，蓋上管蓋，16,000 g（~13000 rpm） 4℃離心1分鐘，離心后收集管底部會(huì)有沉淀形成。

     注：離心柱最大體積為600 μl；確保離心機(jī)可以在10秒內(nèi)達(dá)到16000 g。

   1.3.3 棄去離心柱，蓋好2 ml收集管管蓋，用1ml移液器輕柔吹打重懸收集管中的沉淀。

1.4 去除細(xì)胞核：

溶液700 g（~2700 rpm） 4℃離心1分鐘，用200 μl吸頭小心將上清（上清稍有渾濁）轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml離心管中。注意：轉(zhuǎn)速不要超過(guò)700g，否則會(huì)降低膜蛋白的得率。

     關(guān)鍵步驟：吸取上清時(shí)不要觸及沉淀，甚至可以丟棄部分上清不吸取，以免上清（含膜蛋白）中污染核蛋白。如果使用200 μl提取溶液，建議吸取150 μl上清；使用500 μl提取溶液，建議吸取400 μl上清。此步驟得到的細(xì)胞核純度不高，混雜有沒(méi)有完全破碎的完整細(xì)胞，不建議用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.5 沉淀膜蛋白：

上清溶液16000 g（~13000 rpm） 4℃離心30分鐘，用200 μl吸頭吸棄上清，沉淀即為提取的膜蛋白。上清是胞漿蛋白，如需要可保存?zhèn)溆谩?

關(guān)鍵步驟：此步驟必須完全將上清吸取干凈，可以分次吸取上清，最后用10 μl吸頭將殘余上清徹底吸凈，以免膜蛋白中污染胞漿蛋白。

 二 膜蛋白溶解：

膜蛋白沉淀可以根據(jù)下游實(shí)驗(yàn)需求用50 μl相應(yīng)溶解液溶解。

注：不建議加入超過(guò)50 μl溶解液，會(huì)導(dǎo)致蛋白濃度偏低。

2.1 膜蛋白變性樣品處理：

2.1.1 建議使用50 μl變性蛋白溶解液（貨號(hào)：PS1020）溶解膜蛋白；

2.1.2 BCA方法測(cè)定蛋白濃度；

2.1.3用變性蛋白溶解液調(diào)整蛋白濃度為1 μg/μl，按需分裝，每管50 μl，-80℃保存待用；

2.1.4取一管50 μl樣品加入SDS-PAGE上樣緩沖液（貨號(hào)：PL080，PL113，PL121）處理，建議調(diào)整上樣液濃度為0.5 μg/μl；對(duì)于多次跨膜蛋白（Multi-pass membrane protein）的變性電泳檢測(cè)，樣品建議使用37℃處理30分鐘或者70度處理10分鐘，不要95℃加熱5分鐘，因?yàn)樵?5℃高溫情況下，多次跨膜蛋白極易聚集形成多聚體，樣品會(huì)聚集，WB檢測(cè)會(huì)表現(xiàn)為比實(shí)際蛋白大小更大的分子量；

2.1.5 使用SDS-PAGE凝膠（貨號(hào)：RTD6132，RTD6116）電泳，每個(gè)泳道上樣10-40 μl（5-20 μg）。

2.2 膜蛋白BN非變性樣品處理：

2.2.1 建議使用50 μl膜蛋白重懸液（BN電泳用）（貨號(hào)：PN1020）重懸膜蛋白沉淀；

2.2.2 BCA方法測(cè)定蛋白濃度（貨號(hào)：RTP7102）；

2.2.3 用膜蛋白重懸液（BN電泳用）調(diào)整蛋白濃度為1 μg/μl，按需分裝，每管50 μl，-80℃保存待用；

2.2.4 取一管50 μl樣品，溶化混勻后4℃ 16000 g 5分鐘，去除上清，保留沉淀；

2.2.5 沉淀中加入50 μl膜蛋白增溶液A（貨號(hào)：DM1080），輕柔重懸沉淀，盡量不產(chǎn)生氣泡，冰浴10分鐘；

膜蛋白增溶液A配制方法：在增溶劑粉末管中加入2.5 ml溶解緩沖液，加入超純水精準(zhǔn)定容至5 ml，徹底混勻，增溶液中DDM終濃度為1%。

2.2.6 4℃ 16000 g 15分鐘，取上清至一干凈1.5 ml離心管中即為增溶后膜蛋白溶液（小心不要吸取沉淀），此時(shí)得到的膜蛋白濃度為1 μg/μl，其中去垢劑DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）終濃度為1%；

2.2.7 膜蛋白溶液中加入1/10體積10×膜蛋白A型上樣緩沖液（配套膜蛋白增溶液A使用）（貨號(hào)：PL130），使用BN凝膠電泳（貨號(hào)：RTD6139，RTD6140），每個(gè)泳道上樣5-20 μg。

2.3 膜蛋白等電聚焦樣品處理（2D凝膠第一維電泳）：

建議膜蛋白沉淀中使用溶解液：7 M尿素,2 M硫脲, 2%CHAPS,20mM DTT(自備，試劑盒不提供)。

 三 關(guān)于膜蛋白產(chǎn)量和質(zhì)量的評(píng)價(jià)：

 3.1 膜蛋白產(chǎn)量：

3.2 膜蛋白質(zhì)量評(píng)價(jià)：

膜蛋白質(zhì)量評(píng)價(jià)首先看提取的蛋白是否是膜蛋白，其次要看膜蛋白是否有明顯的富集，其三要看提出的膜蛋白是否有其他組分交叉污染，最后看提取的膜蛋白中是否可以檢測(cè)出目的蛋白。使用專門的膜內(nèi)參檢測(cè)（下表），可以初步確認(rèn)提出的是膜蛋白。膜蛋白是否有效富集需要用總蛋白作為對(duì)照，與總蛋白相比，膜蛋白中膜蛋白內(nèi)參是否有明顯富集。膜蛋白中的交叉污染可以用其他組分內(nèi)參檢測(cè)膜蛋白樣品，如關(guān)注膜蛋白中是否有細(xì)胞核蛋白污染，可以使用核蛋白內(nèi)參如Lamin B1檢測(cè)膜蛋白，檢測(cè)無(wú)條帶即說(shuō)明膜蛋白與細(xì)胞核組分無(wú)交叉污染。用目標(biāo)蛋白抗體檢測(cè)膜蛋白，驗(yàn)證是否可以檢測(cè)到目的蛋白，蛋白大小是否符合預(yù)期。

許多研究人員利用 WB對(duì)分離的膜蛋白進(jìn)行純度檢測(cè)，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)一些常用的胞漿內(nèi)參能在膜蛋白中檢測(cè)到，例如β-actin^[1], GAPDH ^[2] 和  β-tubulin ^[3]，這是由于這些胞漿內(nèi)參不僅存在于胞漿也存在于質(zhì)膜中，因此可以在膜蛋白中檢測(cè)到胞漿內(nèi)參。更多信息，請(qǐng)參閱以下論文：

1. Gruenstein E., et al. (1975). Actin associated with membranes from 3T3 mouse fibroblast and Hela cells. Journal of cell Biology. 64:223-234.  

2. Terrasse R., et al. (2012). Human and pneumococcal cell surface glyceraldehydes  -3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) proteins are both ligands of human C1q protein. J. Biol. Chem. 287:42620-42633.

3. Wolff J. (2009). Plasma membrane tubulin. Biochemica et BiophysicaActa. (BBA)-Biomembranes 1788:1415-1433.

四 實(shí)驗(yàn)示例：

樣品：K562細(xì)胞，膜蛋白提取試劑盒提取膜蛋白（M）和胞漿蛋白（C），RIPA提取總蛋白（TP）

溫度處理：樣品與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（貨號(hào)：PL080）混合，37度處理30min，70度處理10min，95度處理5min

電泳：4-18% RealPAGE預(yù)制膠（貨號(hào)：RTD6119-0420），蛋白上樣量均為5 μg，恒壓200V  55min

轉(zhuǎn)膜：0.45μm PVDF膜，1×RealBlot轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號(hào)：RT5020）濕轉(zhuǎn)，恒流400 mA 35min。

封閉：快速封閉液（貨號(hào)：WR5020）  RT  10 min

剝離：Western一抗二抗去除液（弱堿，溫和型） （貨號(hào)：WS1200），37度搖床15 min

一抗：1 Na-K ATPase  1:5000；2 Calnexin 1:500；3 β-Tubulin 1:5000 ；4 β-Actin 1:10000；5 GAPDH 1:10000； 6 H3 1:10000；7 COXIV 1:5000；常溫?fù)u床孵育60min

二抗：羊抗兔IgG-HRP 1:5000（貨號(hào)：HGR1020），羊抗鼠IgG-HRP 1:5000（貨號(hào)：HGM1060），常溫?fù)u床孵育60min

檢測(cè)：ECL發(fā)光檢測(cè)（貨號(hào)：EC2520）